江川紀念 SETA 研究室新世代細胞
免疫治療研究室

對肝細胞癌的治療方法包括手術療法、肝動脈栓塞術（TAE）、射頻消融（RFA）等局部療法，以及使用細胞毒性藥物的化學療法。肝癌治療中最大的問題在于，即使早期發現局部根治后復發率仍然很高，單病灶切除術后的3年復發率高達72%。臨床報告顯示TAE術后實施RFA的臨床試驗中，1、3、5年的無復發率分別為64.5%、40.1%、18.0%。報告中治療方法TAE中包括使用化學藥物的TACE治療。經過TAE后RFA的病例中，長期仍保持高復發率，從而復發時仍需要同樣的治療，反復治療后的病例都顯示了長期預后惡化的傾向。

肝動脈栓塞術（TAE）是用導管經動脈接近病變處，注入血管栓塞物質來治療的方法。在狹義上講是對腫瘤“段軍糧”的方法。在廣義上講是通過栓塞物質調整血流走向，提高局部病灶的藥物分布以加強療效的方法。
為了進一步提高該療法的療效本臨床試驗用DDS（Drug & Dendritic cell Delivery System）將抗癌藥物、樹突狀細胞緩慢釋放到治療目標，以促進臨床研究。

本試驗基于腫瘤免疫循環的基礎，以下說明。經局部治療（RFA）后癌細胞陷入程序死亡狀態，激活抗原提示細胞即樹突狀細胞（dendritic cells）并使之成熟，DC游走至淋巴結內，在此處開始誘導激活T細胞。被激活的T細胞通過血管浸潤到腫瘤組織內，開始攻擊癌細胞。我們設想向進入程序死亡的癌組織追加注射樹突狀細胞后，可能會誘發更強烈的抗腫瘤免疫反應。期待單一細胞可以組織肝癌的復發。

多項臨床研究的結果匯總。左側圖表顯示的是副作用，與沒有投放樹突狀細胞的TAE比較，投放各種樹突狀細胞引起發熱，發熱的持續時間卻沒有延長，沒有發生NCI-CTC3級以上有害事件。右側圖表顯示的是無復發生存率，與TAE比較，投放了OK432刺激的樹突狀細胞的明顯抑制了復發。說明使用OK432刺激的樹突狀細胞激活了腫瘤免疫應答，抑制了肝細胞癌的復發。該臨床研究的成果顯示，TAE治療的癌細胞程序死亡可作為腫瘤免疫循環的起動劑，再投放的樹突狀細胞加速了免疫反應，從結果上抑制了腫瘤細胞的增殖。

下面，我們比較了TAE+RFA治療和TAE+RFA+OK432治療的案例。治療組合對照組病例中，在臨床因素、慢性肝病的發展程度、腫瘤病期、腫瘤數量、最大腫瘤直徑、AFP數據上沒有有效差異。

我們論證了樹突狀細胞治療抑制肝細胞癌復發的作用機理。圖表上部分顯示使用ELISPOT測量CD8+T細胞對癌抗原肽的反應程度。使用OK432刺激樹突狀細胞治療后，誘導了部分抗原的反應。從DTH皮內反應觀察，CD4+T細胞被誘導。圖表下部分顯示了使用BioPlex測量的主要細胞因子、驅動因子的觀察結果。

我們觀察到IL-９、IL-15、TNF-α、Eotaxin、MIP-1β等Ⅰ型輔助T細胞的細胞因子與樹突狀細胞的有無反應是不同的。也就是說，在沒有投放樹突狀細胞時（白色）細胞因子反應不良，投放OK432樹突狀細胞（紅色）后細胞因子開始增加。相對Ⅰ型，與Ⅱ型輔助T細胞相關的IL-4、IL-10因子在投放前后沒有變化。此外，接受治療后，骨髓由來的抗腫瘤免疫細胞（MDSC）活性有下降傾向。從這些結果推斷，OK432誘導了Ⅰ型輔助T細胞的免疫反應，同時也減輕了免疫抑制壓力，發揮了抗腫瘤效果。
以上的研究結果顯示，從末梢血液誘導培養的樹突狀細胞投入肝癌的局部治療方法，能夠增強T細胞介入的全身性腫瘤免疫治療效果，可以作為抑制腫瘤復發的治療方法。

常用的免疫細胞療法中，很難增殖免疫功能低下患者的淋巴細胞（LAK），不容易培養足夠的數量。而且癌細胞本身具備的免疫逃逸機制使投放LAK效果不佳，也是個臨床運用的難題。在此背景下，我們期待利用組織工程學的方法嵌合抗原受體，改變基因的T細胞療法能夠解決這些問題。

①構造
在CAR的基本構造中，由1）識別抗體中的靶點，特異性結合部位（scFv）；2）細胞膜貫通部位；3）細胞活化部位（CD３ζ鎖鏈）3個部分構成了嵌合蛋白（第1代）。為了增加T細胞的活性，現在已經有了第2代、第3代的改良，CD28、41BB。

※1 嵌合蛋白：基因轉換技術可結合不同蛋白

②CAR的特點
改變CAR的標的結合部位（scFv），可以產生針對各種靶點的具有特異性和攻擊性的效應T細胞（CTL）。此外，只利用抗體標的進行識別，不用考慮癌細胞的MHC識別路徑，與通常使用的必須通過MHC識別的CTL相比，沒有MHC表達的癌細胞也可以被識別。也就是說，CAR的識別能力比通常免疫細胞治療的CTL的特異性更優越，可以期待更高的免疫聚集性（發現標的開始攻擊的結合能力）。

③CAR-T細胞療法
從患者末梢采集血液中的單核細胞，在抗CD3抗體和IL-2環境中培養后，對激活了的T細胞使用病毒載體，導入CAR基因（DNA）。導入基因后，再培養數日。
※２ 抗CD3抗體和IL-2是激活、增殖T細胞的必須因子。

【國外(美國)】
針對白血病和淋巴瘤使用CD19特異的CAR療法，針對神經母細胞瘤使用GD2特異的CAR療法，臨床試驗進展最迅速，有部分文獻報告了明顯的治療效果。

利用CAR-T細胞治療的問題，主要有以下3點。
① 期待較高的治療效果的同時，具有容易誘發嚴重的自體免疫疾?。毎蜃俞尫啪C合征等）的風險（有死亡案例）。
② 可作為CAR的標的抗原種類多，但是細胞內的抗原，很難被CAR識別。
③ CAR的標的抗原，因癌種而不同，需要分別鑒別癌種（患者）的個體特異性scFv（識別標的的部位）

滉志會與大阪大學一起，正在研究開發制作針對“血管內皮增殖因子受體VEGFR2的CAR識別CTL（CAR-T）。

【特點】
用EP法將flk１特異的結合部位（scFv）+細胞膜貫通部位+細胞活化擔當部位（CD28及CD3ζ）CAR（第2代）的mRNA導入T細胞。
※3 EP法：電刺激細胞后細胞短時間內開口，從開口處將mRNA、蛋白質等導入細胞的技術。

人類免疫系統不僅僅清除入侵機體的細菌和毒素，也是腫瘤能機體內發生疾病時的自然防御系統。這個系統也稱為“腫瘤免疫循環”（Chen and Mallman, 2013)⁽¹⁾。目前的研究表明，人類免疫細胞是按照以下過程清除體內癌細胞的。

1. 發現癌細胞的樹突狀細胞貪食變異了的抗原，并識別它。
2. 樹突狀細胞向T細胞遞程已經識別了的抗原，誘導效應性T細胞（CTL）的活性。
3. 激活的CTL浸潤到腫瘤微環境。
4. CTL識別腫瘤細胞后與其結合。
5. 結合了癌細胞的CTL釋放細胞傷害物質（穿孔素、分解酶等），導致癌細胞凋亡（程序化死亡）。
6. 凋亡的癌細胞釋放出變異抗原和相關抗原（TAA）。這些被釋放的抗原再被樹突狀細胞識別，開始下一次免疫循環（1~6），周而復始激活免疫。

在腫瘤免疫虛幻中，增強并活化CTL的免疫細胞療法，與解除阻礙該免疫循環的免疫檢查點抑制劑聯合使用，可期待治療效果。

近年來，在腫瘤治療領域免疫細胞療法和免疫檢查點抑制劑得到關注，細胞毒性T細胞（CTL）的激活和免疫抑制因子的控制都是必要的。一方面，免疫檢查點抑制劑解除免疫抑制后間接誘導免疫應答，其他藥物治療無效的患者用該藥有效，但是受眾率有限。比如Opdivo治療非小細胞肺癌受益者只有2成^(3)(4)(5)。為了得到更好的免疫應答，有必要考慮在免疫增強和抑制解除方面同時著手。我們一方面期待這種聯合免疫療法能為患者帶來福祉，但是其安全性至今沒有得到充分的評估和驗證。因此，治療開始前為希望治療的患者提供特定的標志物預判，治療開始后盡早能評測治療效果，以及確定治療時間都需要由切實可行的指標來明確，雖然目前有很多研究正在這方面努力，但是仍然沒有找到明確的標志物。關于Opdivo的安全性，一方面沒有化療的副作用強烈，另一方面卻有嚴重的副作用出現，使用Opdivo時，必須有緊急情況的應對方案，以及完整的管理體系⁽⁶⁾。實際上，已經有過使用免疫檢查點抑制劑后再使用免疫細胞治療的死亡案例，雖然沒有證據顯示他們有明確的相關性，但是日本勞動厚生省已經發文（平縣成28年7月28日）要求醫療機構引起重視，慎用聯合療法。
在這樣的背景下，為了確立安全且更有效的治療方法，實現普及，本研究將科學地評估免疫細胞療法聯合免疫檢查點抑制劑為患者帶來的好處，在腫瘤治療方面，這非常重要。